Warning: Undefined property: Dissovet\Models\Dissertation::$performed_in_place2 in /var/www/application/Models/Dissertation.php on line 326
Диссертация

Диссертация

Васильев Руслан Алексеевич

Кандидат наук

Статус диссертации

07.04.2023 
Диплом Кандидат наук
20.03.2023 
Решение о выдаче диплома
17.03.2023 
Положительное заключение АК
17.01.2023 
На рассмотрении в АК
10.11.2022 
Положительная защита
28.09.2022 
Объявление опубликовано
22.09.2022 
Принят к защите
20.09.2022 
Заключение комиссии
19.09.2022 
Документы приняты
ФИО соискателя
Васильев Руслан Алексеевич
Степень на присвоение
Кандидат наук
Приказ о выдаче диплома
№ 405 от 07.04.2023
Дата защиты
10.11.2022
Место проведения защиты
119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Биологический факультет, ауд. 389.
Научный руководитель
Каменский Петр Андреевич
Доктор наук
Оппоненты
Сергиев Петр Владимирович
Член - корреспондент РАН Доктор наук
Шайтан Алексей Константинович
Член - корреспондент РАН Доктор наук
Дивашук Михаил Георгиевич
Кандидат наук
Место выполнения работы
Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Биологический факультет
Специальность
03.01.03 Молекулярная биология
биологические науки
Диссертационный совет
Телефон совета
+7 495 939-33-60

Целью данной работы является получение и характеристика новой эндонуклеазы семейства Cas12a, способной вносить направленные модификации в геном клеток человека. Задачи: 1. Биоинформатический поиск нуклеотидной и аминокислотной последовательностей новой, патентно-чистой нуклеазы Cas подтипа V-A. 2. Получение рекомбинантного белка и определение его активности в составе комплексов с различными crРНК в условиях in vitro. 3. Исследование требований к PAM-последовательности новой нуклеазы Cas подтипа V-A. 4. Определение свойств новой нуклеазы Cas подтипа V-A в условиях in vitro: кофактор-зависимость, температурный оптимум работы, определение структуры выступающих концов, наличие коллатеральной активности. 5. Исследование возможности осуществления разрезания in vitro комплексами различных Cas-нуклеаз подтипа V-A, заряженными двумя молекулами РНК: отдельно спейсерной и скаффолдной частями crРНК. 6. Исследование возможности получения направленной делеции в гене DNMT1 в геноме культуры клеток HEK293T при помощи новой нуклеазы Cas подтипа V-A. Научная новизна: В работе впервые была показана и изучена активность эффекторной нуклеазы системы CRISPR/Cas подтипа V-A из бактерии Ruminococcus bromii sp. (RbCas12a). Продемонстрирована способность нуклеазы RbCas12a в комплексах с crРНК осуществлять гидролиз дцДНК in vitro. Показана активность RbCas12a in vitro в отношении ДНК, содержащих PAM-последовательности с консенсусом 5′-YYN-3′. Выявлена независимость эффективности разрезания от последнего нуклеотида PAM в отношении одного и того же протоспейсера; в частности, не наблюдалось дискриминации в отношении тимидинового нуклеотида в последнем положении PAM, свойственной некоторым ортологам Cas12a.Проведен анализ свойств нуклеазы RbCas12a, подтверждающий наибольшую активность фермента при использовании в качестве кофакторов ионы магния или марганца. Проведен сравнительный анализ зависимости эффективности разрезания матрицы от времени инкубации с комплексами RbCas12a/crРНК и AsCas12a/crРНК, продемонстрировавший высокую эффективность разрезания RbCas12a спустя несколько секунд инкубации. Проведен сравнительный анализ активности комплекса RbCas12a/crРНК при различных температурах, по результатам которого обнаружено, что комплекс способен эффективно функционировать при диапазоне температур от 20 до 42 °C. Впервые показано, что различные ортологи Cas12a, включая RbCas12a, способны формировать эффекторные комплексы с двумя отдельными молекулами РНК, функционирующими соответственно как спейсерная и скаффолдная части crРНК, практически не теряя при этом эффективности в условиях in vitro. Продемонстрирована возможность разрезания in vitro матрицы комплексами Cas12a только со спейсерной частью crРНК при отсутствии скаффолда. Показано, что RbCas12a проявляет коллатеральную активность в отношении оцДНК. Определена природа выступающих концов при гидролизе ДНК матрицы комплексом RbCas12a-crРНК: формирование 5′-выступающих концов на 1 нуклеотид длиннее, чем при гидролизе ортологом Cas12a из Francisella novicida (FnCas12a). Показана возможность внесения направленных делеций в геном культуры клеток человека HEK293T с использованием кодон-оптимизированного RbCas12a.