Диссертация
Васильев Руслан Алексеевич
Кандидат наук
Статус диссертации
Доктор наук
Член - корреспондент РАН Доктор наук
Шайтан Алексей Константинович
Член - корреспондент РАН Доктор наук
Дивашук Михаил Георгиевич
Кандидат наук
биологические науки
Целью данной работы является получение и характеристика новой эндонуклеазы семейства Cas12a, способной вносить направленные модификации в геном клеток человека. Задачи: 1. Биоинформатический поиск нуклеотидной и аминокислотной последовательностей новой, патентно-чистой нуклеазы Cas подтипа V-A. 2. Получение рекомбинантного белка и определение его активности в составе комплексов с различными crРНК в условиях in vitro. 3. Исследование требований к PAM-последовательности новой нуклеазы Cas подтипа V-A. 4. Определение свойств новой нуклеазы Cas подтипа V-A в условиях in vitro: кофактор-зависимость, температурный оптимум работы, определение структуры выступающих концов, наличие коллатеральной активности. 5. Исследование возможности осуществления разрезания in vitro комплексами различных Cas-нуклеаз подтипа V-A, заряженными двумя молекулами РНК: отдельно спейсерной и скаффолдной частями crРНК. 6. Исследование возможности получения направленной делеции в гене DNMT1 в геноме культуры клеток HEK293T при помощи новой нуклеазы Cas подтипа V-A. Научная новизна: В работе впервые была показана и изучена активность эффекторной нуклеазы системы CRISPR/Cas подтипа V-A из бактерии Ruminococcus bromii sp. (RbCas12a). Продемонстрирована способность нуклеазы RbCas12a в комплексах с crРНК осуществлять гидролиз дцДНК in vitro. Показана активность RbCas12a in vitro в отношении ДНК, содержащих PAM-последовательности с консенсусом 5′-YYN-3′. Выявлена независимость эффективности разрезания от последнего нуклеотида PAM в отношении одного и того же протоспейсера; в частности, не наблюдалось дискриминации в отношении тимидинового нуклеотида в последнем положении PAM, свойственной некоторым ортологам Cas12a.Проведен анализ свойств нуклеазы RbCas12a, подтверждающий наибольшую активность фермента при использовании в качестве кофакторов ионы магния или марганца. Проведен сравнительный анализ зависимости эффективности разрезания матрицы от времени инкубации с комплексами RbCas12a/crРНК и AsCas12a/crРНК, продемонстрировавший высокую эффективность разрезания RbCas12a спустя несколько секунд инкубации. Проведен сравнительный анализ активности комплекса RbCas12a/crРНК при различных температурах, по результатам которого обнаружено, что комплекс способен эффективно функционировать при диапазоне температур от 20 до 42 °C. Впервые показано, что различные ортологи Cas12a, включая RbCas12a, способны формировать эффекторные комплексы с двумя отдельными молекулами РНК, функционирующими соответственно как спейсерная и скаффолдная части crРНК, практически не теряя при этом эффективности в условиях in vitro. Продемонстрирована возможность разрезания in vitro матрицы комплексами Cas12a только со спейсерной частью crРНК при отсутствии скаффолда. Показано, что RbCas12a проявляет коллатеральную активность в отношении оцДНК. Определена природа выступающих концов при гидролизе ДНК матрицы комплексом RbCas12a-crРНК: формирование 5′-выступающих концов на 1 нуклеотид длиннее, чем при гидролизе ортологом Cas12a из Francisella novicida (FnCas12a). Показана возможность внесения направленных делеций в геном культуры клеток человека HEK293T с использованием кодон-оптимизированного RbCas12a.
# | Название | Размер |
---|---|---|
1 | Заключение по диссертации | 59 KB |
2 | Отзыв официального оппонента | 935 KB |
3 | Отзыв официального оппонента | 1 MB |
4 | Отзыв официального оппонента | 1 MB |
5 | Автореферат | 3 MB |
6 | Дополнительный отзыв на диссертацию или реферат | 2 MB |
7 | Дополнительный отзыв на диссертацию или реферат | 2 MB |
8 | Дополнительный отзыв на диссертацию или реферат | 2 MB |
9 | Диссертация | 1 MB |
10 | Отзыв научного руководителя (консультанта) | 235 KB |
11 | Сведения о научных руководителях (консультантах) | 503 KB |
12 | Сведения об официальных оппонентах, включая публикации | 545 KB |