Warning: Undefined property: Dissovet\Models\Dissertation::$performed_in_place2 in /var/www/application/Models/Dissertation.php on line 354
Диссертация

Диссертация

Хромов Андрей Владимирович

Кандидат наук

Статус диссертации

09.04.2021 
Диплом Кандидат наук
29.03.2021 
Решение о выдаче диплома
19.03.2021 
Положительное заключение АК
19.01.2021 
На рассмотрении в АК
19.11.2020 
Положительная защита
17.10.2020 
Объявление опубликовано
08.10.2020 
Принят к защите
05.10.2020 
Заключение комиссии
02.10.2020 
Документы приняты
ФИО соискателя
Хромов Андрей Владимирович
Степень на присвоение
Кандидат наук
Приказ о выдаче диплома
№ 298 от 09.04.2021
Дата и время защиты
19.11.2020 17:00
Научный руководитель
Калинина Наталья Олеговна
Доктор наук Профессор
Оппоненты
Чирков Сергей Николаевич
Доктор наук
Соловьев Александр Александрович
Доктор наук
Эльдаров Михаил Анатольевич
Кандидат наук
Место выполнения работы
Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, Отдел биохимии вирусов растений
Специальность
03.01.03 Молекулярная биология
биологические науки
Диссертационный совет
Телефон совета
+7 495 939-33-60

Прямая трансляция защиты: http://www.bio.msu.ru/dissertations/view.php?ID=974 Актуальность темы исследования Известно, что вирусные инфекции являются причиной почти половины всех эпифитотий сельскохозяйственных культур. В настоящее время новые технологии редактирования генома открывают широкие возможности для генерации растений, устойчивых к различным инфекциям. Новейшей и самой передовой технологией редактирования генов, которая может быть использована для достижения этой цели, является технология CRISPR/Cas. Эта технология уже произвела революцию в различных областях наук о жизни, в частности в медицине и биотехнологии, и предлагает новый, мощный альтернативный (или дополнительный) подход к классической селекции растений для улучшения их характеристик. Учитывая, что вирусы растений могут вызывать огромные потери урожайности сельскохозяйственных культур, неудивительно, что в последние годы проявился интерес к использованию различных аспектов технологий CRISPR/Cas для создания растений, устойчивых к вирусным патогенам. Степень разработанности темы. Для достижения этой цели системы CRISPR/Cas можно использовать двумя основными способами: (1) путём прямого нацеливания на вирусные геномы и (2) путём внесения целевых мутаций в конкретные гены растений-хозяев, белки, кодируемые которыми, используются вирусом для успешной репликации и распространении в растении. Первый способ используется в настоящее время большинством исследователей. Практическое применение технологии CRISPR/Cas сталкивается с рядом «узких» мест, решение которых имеет принципиальное значение для редактирования генов растений, одним из которых является метод доставки компонентов редактирующего комплекса Cas9/короткая гидовая РНК в растения. Доставка генов с использованием плазмидной ДНК и агробактериальной трансформации (основной применяемый метод) приводит к получению трансгенных растений, использование которых запрещено законодательством многих странах. Предпочтительными являются методы прямой (бесплазмидной) доставки кгРНК и белка Cas9, которые активно разрабатываются в последнее время. Цели и задачи исследования Целью настоящей работы является получение редактированных линий картофеля, устойчивых к вирусной инфекции, с помощью технологии CRISPR/Cas с применением бесплазмидного способа доставки редактирующего комплекса. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1.Разработать способ доставки в клетки растений Nicotiana benthamiana и Solanum tuberosum платформ на основе микрочастиц хитозана с иммобилизованными на их поверхности флуоресцентно меченными модельными белками и короткими РНК методом инфильтрации в клетки растений. 2.Отработать условия доставки редактирующего комплекса (рекомбинантная эндонуклеаза Cas:кгРНК) в клетки меристем растений картофеля S.tuberosum с использованием платформ на основе микрочастиц хитозана и микрочастиц золота. 3.С использованием бесплазмидных технологий доставки редактирующих компонентов системы CRISPR/Cas9 в клетки меристем растений картофеля провести редактирование двух генов – гена PDS и гена коилина. 4.Провести функциональный анализ гена коилина в устойчивости редактированных линий растений картофеля к инфекции Y вирусом картофеля (YВК) и абиотическим стрессам. Практическая значимость исследования Новый метод доставки редактирующего комплекса в клетки меристем растений с использованием микрочастиц хитозана и метода вакуумной инфильтрации перспективен для создания редактированных линий растений различных видов, не относящихся к ГМО. Ген коилина представляет собой перспективную мишень для получения линий и сортов сельскохозяйственных растений (прежде всего картофеля), устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам. Методология и методы исследования. Исследования выполнены с использованием современных методов генной инженерии молекулярной биологии и вирусологии. Доставка редактирующего комплекса (рекомбинантная эндонуклеаза:кгРНК) в клетки меристем растений картофеля S.tuberosum проводили путем бомбардмента или вакуумной инфильтрации с использованием в качестве платформ микрочастиц золота и микрочастиц хитозана. Дизайн коротких гидовых РНК осуществляли с использованием современных сервисов, для последующего синтеза кгРНК использовали клонирование и транскрипцию in vitro. Уровень экспрессии редактированных генов растений оценивали методом ОТ-ПЦТ и ПЦР-РВ. Факт редактирования гена оценивали методами фрагментного анализа, генотипированием и методом глубокого секвенирования (NGS) фрагмента редактируемых последовательностей. Оценку устойчивости редактированных растений к вирусной инфекции проводили с использованием метода ИФА и ПЦР-РВ. Работа выполнена с использованием современного оборудования.

# Название Размер