Диссертация

Прямая трансляция защиты: http://www.bio.msu.ru/dissertations/view.php?ID=974 Цель работы: Исследование роли ядерных белков, коилина и фибрилларина, в защитном ответе растений на заражение вирусом погремковости табака (ВПТ, род Tobravirus) и Y вирусом картофеля (YВК, род Potyvirus). Задачи: -Изучение взаимодействия коилина и белка 16К ВПТ и его роли в активации защитного ответа, опосредованного салициловой кислотой (СК). -Изучение характера интерактивных ответов контрастных по отношению к стрессам различной природы растений картофеля. -Исследование роли СК в защитном ответе растений картофеля на инфекцию YВК -Анализ молекулярных ответов трансгенных растений картофеля с гиперэкспрессией и растений с пониженным уровнем экспрессии коилина и фибрилларина на вирусную инфекцию и тепловой стресс. -Выявление прямого взаимодействия ядерных белков между собой. Научная новизна. Показано, что оздоровление растений Nicotiana tabacum и Nicotiana benthamiana от ВПТ на поздних сроках инфекции регулируется механизмом, зависимым от коилина, белка телец Кахаля (ТК). Коилин взаимодействует с вирусным белком 16К, перераспределяется из ТК в ядрышко, что приводит к индукции биосинтеза/накопления фитогормона салициловой кислоты (СК) в ответ на инфекцию ВПТ и вызывает активацию поздних стадий базового защитного ответа растения, зависимых от СК. Показано, что интерактивные ответы растений картофеля (Solanum tuberosum L.), контрастных по отношению к инфекции YВК и повышенной температуре существенно различаются уровнем экспрессии генов PR-белков, маркеров сигнального пути, регулируемого СК, и белков теплового шока. Фенотип растений восприимчивого сорта Чикаго меняется на резистентный при обработке СК, что сопровождается значительным увеличением экспрессии генов PR-белков и генов HSP. С использованием трансгенных растений картофеля с гиперэкспрессией генов коилина и фибрилларина показано, что эти ядерные белки являются негативными регуляторами защитного ответа на стресс. Негативный эффект гиперэкспрессии снимается при обработке трансгенных растений экзогенной СК. Ингибирование экспрессии фибрилларина и коилина в растениях картофеля по механизму РНК-интерференции приводит к молекулярным изменениям в сигнальных зависимых от СК защитных путях и усиливает защитную реакцию растения, приводя к формированию устойчивости растений картофеля к YВК. Продемонстрировано прямое взаимодействие между коилином и фибрилларином. Предполагается, что оба белка участвуют в общем сигнальном пути защитного ответа растения на биотический и абиотический стрессы, контролируемого в основном СК. Научная и практическая значимость. Полученные данные о роли ядерных белков коилина в фибрилларина в защитном ответе растений на вирусную инфекцию расширяют наши знания о механизмах взаимодействия растений и вирусов и неканонических функциях ядерных белков. Идентифицированные ядерные белки, контролирующие ответы на стресс биотической и абиотической природы, могут рассматриваться как перспективные мишени для селекционного процесса и создания с использованием технологий редактирования генов устойчивых сортов важных сельскохозяйственных культур (например, картофеля). Использованная в данной работе технология обработки растений дцРНК к гену интереса для подавления его экспрессии представляется перспективной для практического применения. Методология и методы исследования. Исследования выполнены с использованием современных методов молекулярной биологии, вирусологии, генной инженерии и клеточной биологии. Уровень экспрессии генов растений оценивали методом ПЦР в режиме реального времени. Для подавления экспрессии генов коилина и фибрилларина использовали метод вирус-индуцированного сайленсинга генов и новый метод обработки растений экзогенной дцРНК, комплементарной гену-интереса. Исследования релокализации белков в ядре изучали методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Для выявления белок-белковых взаимодействий был использован широкий спектр методов - дрожжевая двугибридная система, Фар-Вестерн блоттинг, ко-иммунопреципитация и бимолекулярная флуоресцентная комплементация. Работа выполнена с использованием современного оборудования.