Диссертация

Целью данной работы является получение и характеристика новой эндонуклеазы семейства Cas12a, способной вносить направленные модификации в геном клеток человека. Задачи: 1. Биоинформатический поиск нуклеотидной и аминокислотной последовательностей новой, патентно-чистой нуклеазы Cas подтипа V-A. 2. Получение рекомбинантного белка и определение его активности в составе комплексов с различными crРНК в условиях in vitro. 3. Исследование требований к PAM-последовательности новой нуклеазы Cas подтипа V-A. 4. Определение свойств новой нуклеазы Cas подтипа V-A в условиях in vitro: кофактор-зависимость, температурный оптимум работы, определение структуры выступающих концов, наличие коллатеральной активности. 5. Исследование возможности осуществления разрезания in vitro комплексами различных Cas-нуклеаз подтипа V-A, заряженными двумя молекулами РНК: отдельно спейсерной и скаффолдной частями crРНК. 6. Исследование возможности получения направленной делеции в гене DNMT1 в геноме культуры клеток HEK293T при помощи новой нуклеазы Cas подтипа V-A. Научная новизна: В работе впервые была показана и изучена активность эффекторной нуклеазы системы CRISPR/Cas подтипа V-A из бактерии Ruminococcus bromii sp. (RbCas12a). Продемонстрирована способность нуклеазы RbCas12a в комплексах с crРНК осуществлять гидролиз дцДНК in vitro. Показана активность RbCas12a in vitro в отношении ДНК, содержащих PAM-последовательности с консенсусом 5′-YYN-3′. Выявлена независимость эффективности разрезания от последнего нуклеотида PAM в отношении одного и того же протоспейсера; в частности, не наблюдалось дискриминации в отношении тимидинового нуклеотида в последнем положении PAM, свойственной некоторым ортологам Cas12a.Проведен анализ свойств нуклеазы RbCas12a, подтверждающий наибольшую активность фермента при использовании в качестве кофакторов ионы магния или марганца. Проведен сравнительный анализ зависимости эффективности разрезания матрицы от времени инкубации с комплексами RbCas12a/crРНК и AsCas12a/crРНК, продемонстрировавший высокую эффективность разрезания RbCas12a спустя несколько секунд инкубации. Проведен сравнительный анализ активности комплекса RbCas12a/crРНК при различных температурах, по результатам которого обнаружено, что комплекс способен эффективно функционировать при диапазоне температур от 20 до 42 °C. Впервые показано, что различные ортологи Cas12a, включая RbCas12a, способны формировать эффекторные комплексы с двумя отдельными молекулами РНК, функционирующими соответственно как спейсерная и скаффолдная части crРНК, практически не теряя при этом эффективности в условиях in vitro. Продемонстрирована возможность разрезания in vitro матрицы комплексами Cas12a только со спейсерной частью crРНК при отсутствии скаффолда. Показано, что RbCas12a проявляет коллатеральную активность в отношении оцДНК. Определена природа выступающих концов при гидролизе ДНК матрицы комплексом RbCas12a-crРНК: формирование 5′-выступающих концов на 1 нуклеотид длиннее, чем при гидролизе ортологом Cas12a из Francisella novicida (FnCas12a). Показана возможность внесения направленных делеций в геном культуры клеток человека HEK293T с использованием кодон-оптимизированного RbCas12a.