Диссертация

Прямая трансляция защиты: http://www.bio.msu.ru/dissertations/view.php?ID=974 Актуальность темы исследования Известно, что вирусные инфекции являются причиной почти половины всех эпифитотий сельскохозяйственных культур. В настоящее время новые технологии редактирования генома открывают широкие возможности для генерации растений, устойчивых к различным инфекциям. Новейшей и самой передовой технологией редактирования генов, которая может быть использована для достижения этой цели, является технология CRISPR/Cas. Эта технология уже произвела революцию в различных областях наук о жизни, в частности в медицине и биотехнологии, и предлагает новый, мощный альтернативный (или дополнительный) подход к классической селекции растений для улучшения их характеристик. Учитывая, что вирусы растений могут вызывать огромные потери урожайности сельскохозяйственных культур, неудивительно, что в последние годы проявился интерес к использованию различных аспектов технологий CRISPR/Cas для создания растений, устойчивых к вирусным патогенам. Степень разработанности темы. Для достижения этой цели системы CRISPR/Cas можно использовать двумя основными способами: (1) путём прямого нацеливания на вирусные геномы и (2) путём внесения целевых мутаций в конкретные гены растений-хозяев, белки, кодируемые которыми, используются вирусом для успешной репликации и распространении в растении. Первый способ используется в настоящее время большинством исследователей. Практическое применение технологии CRISPR/Cas сталкивается с рядом «узких» мест, решение которых имеет принципиальное значение для редактирования генов растений, одним из которых является метод доставки компонентов редактирующего комплекса Cas9/короткая гидовая РНК в растения. Доставка генов с использованием плазмидной ДНК и агробактериальной трансформации (основной применяемый метод) приводит к получению трансгенных растений, использование которых запрещено законодательством многих странах. Предпочтительными являются методы прямой (бесплазмидной) доставки кгРНК и белка Cas9, которые активно разрабатываются в последнее время. Цели и задачи исследования Целью настоящей работы является получение редактированных линий картофеля, устойчивых к вирусной инфекции, с помощью технологии CRISPR/Cas с применением бесплазмидного способа доставки редактирующего комплекса. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1.Разработать способ доставки в клетки растений Nicotiana benthamiana и Solanum tuberosum платформ на основе микрочастиц хитозана с иммобилизованными на их поверхности флуоресцентно меченными модельными белками и короткими РНК методом инфильтрации в клетки растений. 2.Отработать условия доставки редактирующего комплекса (рекомбинантная эндонуклеаза Cas:кгРНК) в клетки меристем растений картофеля S.tuberosum с использованием платформ на основе микрочастиц хитозана и микрочастиц золота. 3.С использованием бесплазмидных технологий доставки редактирующих компонентов системы CRISPR/Cas9 в клетки меристем растений картофеля провести редактирование двух генов – гена PDS и гена коилина. 4.Провести функциональный анализ гена коилина в устойчивости редактированных линий растений картофеля к инфекции Y вирусом картофеля (YВК) и абиотическим стрессам. Практическая значимость исследования Новый метод доставки редактирующего комплекса в клетки меристем растений с использованием микрочастиц хитозана и метода вакуумной инфильтрации перспективен для создания редактированных линий растений различных видов, не относящихся к ГМО. Ген коилина представляет собой перспективную мишень для получения линий и сортов сельскохозяйственных растений (прежде всего картофеля), устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам. Методология и методы исследования. Исследования выполнены с использованием современных методов генной инженерии молекулярной биологии и вирусологии. Доставка редактирующего комплекса (рекомбинантная эндонуклеаза:кгРНК) в клетки меристем растений картофеля S.tuberosum проводили путем бомбардмента или вакуумной инфильтрации с использованием в качестве платформ микрочастиц золота и микрочастиц хитозана. Дизайн коротких гидовых РНК осуществляли с использованием современных сервисов, для последующего синтеза кгРНК использовали клонирование и транскрипцию in vitro. Уровень экспрессии редактированных генов растений оценивали методом ОТ-ПЦТ и ПЦР-РВ. Факт редактирования гена оценивали методами фрагментного анализа, генотипированием и методом глубокого секвенирования (NGS) фрагмента редактируемых последовательностей. Оценку устойчивости редактированных растений к вирусной инфекции проводили с использованием метода ИФА и ПЦР-РВ. Работа выполнена с использованием современного оборудования.