Warning: Undefined property: Dissovet\Models\Dissertation::$performed_in_place2 in /var/www/application/Models/Dissertation.php on line 354
Диссертация

Диссертация

Сидоренко Светлана Вадимовна

Кандидат наук

Статус диссертации

19.06.2019 
Диплом Кандидат наук
17.06.2019 
Решение о выдаче диплома
10.06.2019 
Положительное заключение АК
08.05.2019 
На рассмотрении в АК
08.04.2019 
Положительная защита
06.03.2019 
Объявление опубликовано
05.03.2019 
Принят к защите
01.03.2019 
Заключение комиссии
25.02.2019 
Документы приняты
ФИО соискателя
Сидоренко Светлана Вадимовна
Степень на присвоение
Кандидат наук
Приказ о выдаче диплома
№ 798 от 19.06.2019
Дата и время защиты
08.04.2019 15:30
Научный руководитель
Орлов Сергей Николаевич
Доктор наук Профессор
Оппоненты
Гайнуллина Дина Камилевна
Кандидат наук
Архипенко Юрий Владимирович
Доктор наук Профессор
Сурин Александр Михайлович
Доктор наук
Место выполнения работы
Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Кафедра биофизики
Специальность
03.03.01 Физиология
03.01.02 Биофизика
биологические науки
Диссертационный совет
Телефон совета
+7 495 939-46-04

Мы провели сравнительный анализ действия гипоксии на эритроциты человека и крысы. Уже в первых экспериментах, проведенных при комнатной температуре, мы обнаружили положительную и высоко достоверную корреляцию между приростом высвобождения АТР и гемоглобина, вызванным 20-мин инкубацией эритроцитов человека в условиях гипоксии. При переходе к физиологическим условиям (to=37oC), мы обнаружили, что в эритроцитах человека гипоксия вызывала увеличение гемолиза на 40%, в то время как в эритроцитах крысы этот параметр увеличивался в 2-3 раза. Для нашего дальнейшего исследования важен был то факт, что в отличие от эритроцитов крысы в эритроцитах человека отмечена существенная индивидуальная вариабельность действия гипоксии. Учитывая это обстоятельство, дальнейшие эксперименты были проведены на эритроцитах крыс линии Вистар. Мы обратили внимание на то, что 2-3-х кратное увеличение высвобождения гемоглобина в ответ на 20-мин гипоксию эритроцитов крысы сопровождалось лишь незначительным и статистически недостоверным приростом содержания внеклеточного АТР, что обусловлено 35-ти кратным увеличением при переходе от комнатной температуры к 37оС активности экто-ATPазы. В самом деле, добавление ингибитора этого фермента (соединение ARL 67156) приводило к резкому приросту содержания внеклеточного ATP, не влияя при этом на высвобождение гемоглобина. В присутствии ARL 67156 нам также удалось зарегистрировать положительную корреляцию прироста высвобождения АТР и гемоглобина из эритроцитов крысы, подвергнутых 20-мин гипоксии при 37оС. Нам не удалось обнаружить достоверного влияния карбенокcолона на выброс ATP из эритроцитов крысы в условиях гипоксии, в то время как незначительное снижение этого параметра в присутствии пробенецида коррелировало с уменьшением гемолиза эритроцитов. В отличие от гипоксии, выброс АТР из эритроцитов крысы, вызванный механическим воздействием (shear stress) блокировался карбенокслолном. Следует, однако отметить, что в этой работе не проводилось одновременная оценка влияния механического воздействия на гемолиз эритроцитов. Последнее обстоятельство оказывается весьма существенным в свете данных о корреляции выброса АТР и гемоглобина из эритроцитов человека в ответ на механическое воздействие, гипотонический шок и добавку диметилсульфоксида, используемого в качестве растворителя гидрофобных соединений. На основании этих результатов мы сделали вывод о том, что нарушение структурной целостности плазматической мембраны вносит существенный вклад в высвобождение АТР из эритроцитов в условиях гипоксии и приступили к изучению механизма этого явления. Используя метод безметочного определения содержания белков, мы сравнили относительное содержание 1159 белков теней эритроцитов, полученных при номоксии и гипоксии в 3 независимых экспериментах. Среди белков, чье содержание в условиях гипоксии увеличивалось более чем в 2 раза, мы обнаружили 6 субъединиц гемоглобина. Эти данные, полученные при деоксигенации интактных эритроцитов, согласуется с результатами предыдущих исследований связывания окисгенированного и дексигенированного гемоглобина с тенями эритроцитов человека. Этот феномен очевидно обусловлен взаимодействием деоксигемоглобина с белком полосы 3, продемонстрированным в опытах по связыванию деоксигемоглобина с цитопламатическим доменом белка полосы 3. В последнее время роль взаимодействия deoxy-Hb с белком полосы 3 в регуляции цитоскелета эритроцитов была подтверждена также в исследовании эритроцитов мышей, содержащих нативный белок полосы 3 человека (w-human Hb site) или белок полосы 3, лишённый сайта связывания deoxy-Hb (w/o Hb site). Эти эксперименты показали, что в отличие от мышей дикого типа и мышей w-human Hb site, дезоксигенирование не оказывает никакого влияния на взаимодействие белка полосы 3 с цитоскелетом и высвобождение ATP из эритроцитов мышей w/o Hb site . В ранних работах было показано, что тени эритроцитов человека обогащены белками мультиферментного комплекса, играющими ключевую роль в регуляции гликолиза. Сравнительно недавно с использованием пермеабилизованных эритроцитов и фермент-специфических антител, было обнаружено, что в условиях гипоксии глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, альдолаза, фосфофруктокиназа, лактат дегидрогеназа и пируваткиназа диссоциируют с внутренней поверхности мембраны. Предполагается, что это явление лежит в основе увеличения метаболизма глюкозы в гликолизе в условиях гипоксии, контролируя тем самым продукцию NADPH и инактивацию АФК. Нам не удалось обнаружить достоверного влияния гипоксии на содержание этих ферментов в тенях эритроцитов крысы. В этой связи можно предположить, что в отличие от белков, перечисленных в Таблице 4, взаимодействие гликолитических ферментов с мембраной обусловлено крайне слабыми взаимодействиями, и различия в их содержании, зарегистрированные в интактных эритроцитах, исчезают в процессе многократной промывки мембран. Исследования последних лет показали, что белки группы Cullin образуют молекулярный каркас, который выполняет решающую роль в посттрансляционной модификации белков посредством их убиквитинилирования. У млекопитающих семейство куллины образовано 8 беклами (CUL1-CUL7 и PARC), которые характеризуются наличием одноименного домена. В свою очередь, белки CUL1-CUL7 образуют субъединичные комплексы с группой Е3 лигазы, состоящей более чем из 200 белков (Cullin-RING E3 ubiquitin ligase complexes, CRL). Эти комплексы переносят убиквитин на белки как метку для их последующей деградации на протеосомах. Анализ данных, полученных с помощью базы данных KEGG, показывает, что большинство белков этого комплекса присутствуют в контрольных образцах и отсутствуют в тенях, полученных из эритроцитов, подвергнутых 20-мин гипоксии. Эти данные позволяют предположить, что в условиях нормоксии этот комплекс ассоциирован с мембраной эритроцитов, осуществляя убиквитинилирование мембранных белков, нарушенных в результате продукции АФК. Другим участником этого процесса могут быть кислород-чувствительные протеазы, вовлеченные в деградацию белков мембранного цитоскелета, включая белок полосы 3, белок 4.1 и гликофорин-С. В условиях гипоксии деоксигемоглобин связывается с цитоплазматическим доменом белка полосы 3, что приводит к высвобождению из мембраны комплекса Cullin-Rbx E3 и нарушению деградации мембранных белков, подвергнутых посттрансляционной модификации. Результатом всех этих изменений структурной организации мембранносвязанных белков является нарушение структурной целостности эритроцитов, приводящие к синхронному высвобождению АТР и гемоглобина, зарегистрированном в наших экспериментах.

# Название Размер