Диссертация

Объекты исследования: эндо-1,4-β-ксиланаза А Penicillium canescens эндо-1,4-β-ксиланаза E Penicillium canescens эндо-1,4-β-ксиланаза III Trichoderma reesei Целями данной работы являлось увеличение методами белковой инженерии температурной стабильности трех грибных ксиланаз из 10-й семьи гликозидгидролаз (ГГ): эндо-1,4-β-ксиланаз А и Е (XylA и XylE) Penicillium canescens, эндо-1,4-β-ксиланазы III (Xyl3) Trichoderma reesei, а также получение мутантных форм ксиланаз XylA и Xyl3, которые обладают резистентностью к белковым ингибиторам злаков типа XIP. Получен ряд мутантных форм ксиланаз XylA, XylE и Xyl3 с одинарными и двойными а.к. заменами, а также с делециями или вставками в а.к. последовательность ферментов. Определены биохимические параметры гомогенных рекомбинантных ксиланаз. Показано, что ряд а.к. замен приводит к снижению термостабильности ксиланаз XylA, XylE и Xyl3; несколько а.к. замен не повлияли на данный параметр. Получены мутантные формы XylA L18F, XylE Y134R, XylE T196P, XylE Y134R/D248E, обладающие более высокой термостабильностью по сравнению с рекомбинантными формами ферментов дикого типа. Установлено, что XylA L18F проявляет повышенную термостабильность за счет заполнения гидрофобной полости белковой глобулы более объемным неполярным остатком фенилаланина, тогда как замены в XylE Y134R и Y134R/D248E приводят к образованию новых солевых мостиков и, как следствие, к увеличению температурной стабильности. Введение остатка пролина в начало α-спирали в XylE (а.к. замена T196P) оказало небольшое положительное влияние на термостабильность за счет увеличения жесткости третичной структуры фермента. Показано, что вставка дополнительных 5 аминокислотных остатков в пептидную петлю в районе активного центра XylA и Xyl3 позволяет ферментам приобрести свойство резистентности к белковым ингибиторам из злаков типа XIP. Область применения: биотехнология