Диссертация

Внутрибольничные инфекции в настоящее время являются актуальной и серьёзной проблемой. Одними из возбудителей этих инфекций являются бактерии рода Klebsiella. Эти патогены вызывают пневмонию, сепсис, воспаление мочеиспускательной системы, проблемы с печенью и почками, а их резистентность к антибиотикам с каждым годом возрастает. Известно, что при обработке антибактериальными агентами эти бактерии переходят в состояние биоплёнки, в котором их устойчивость значительно повышается. Особо остро проблема биоплёнок клебсиелл стоит в области трансплантологии суставов. В среднем каждая 25-30-я операция сопровождается сепсисом, вызванным стафилококком или клебсиеллой, которые в этом случае в организме существуют именно в виде биопленок. Поэтому поиск способов борьбы с такими биоплёнками является актуальным на настоящий момент. При проведении совместного культивирования бактерий рода Lactobacillus и бактерий рода Klebsiella оказалось, что существует два штамма лактобактерий - Limosilactobacillus reuteri LR1 и Lacticaseibacillus rhamnosus F, которые проявляют антагонистическое действие к бактериям Klebsiella. Эти штаммы особо интересны потому, что они входят в состав собственной микробиоты кишечника человека, а значит, белки, которые они синтезируют, с высокой долей вероятности не будут вызывать иммунный ответ. Был проведён протеомный анализ как свободных L. reuteri и L. rhamnosus, так и при их совместном культивировании с бактериями рода Klebsiella, и оказалось, что в ответ на действие патогена лактобактерии синтезируют ряд белков, способствующих подавлению роста клебсиелл. Анализ с помощью тандемной MALDI/TOF/TOF спектрометрии показал, что среди этих белков есть гидролазы, способствующие разрушению пептидных сшивок в пептидогликане клебсиелл или углеводного остова этого пептидогликана, белки, гидролизующие нуклеиновые кислоты, а также белки метаболизма, которые синтезируются только в ответ на присутствие клебсиелл. Одним из таких ферментов является рибонуклеозидгидролаза С (RihC) из L. reuteri. RihC катализирует реакцию расщепления рибонуклеозидов до азотистых оснований и рибозы. Этот фермент относится к семейству рибонуклеозидгидролаз, включающему в себя ряд ферментов: IG-NH, IAG-NH, RihA, RihB и RihC. IG-NH и IAG-NH являются пурин-специфическими гидролазами, RihA и RihB являются пиримидин-специфическими гидролазами, тогда как RihC катализирует реакции как с пиримидинами, так и с пуринами. Не до конца ясна физиологическая роль данного фермента в лактобактериях и то, почему он синтезируется именно в ответ на присутствие патогенов. В данной работе был клонирован фермент RihC из L. reuteri и проведена его комплексная структурная и функциональная характеристика, а именно: изучены кинетические свойства с широким рядом субстратов для двух форм фермента, изучена термостабильность двумя методами, рассчитаны активационные параметры инактивации белка, успешно получены кристаллы, разрешена пространственная структура, проведён анализ активного центра и взаимосвязь его структуры со свойствами белка.