Диссертация

Мы провели сравнительный анализ действия гипоксии на эритроциты человека и крысы. Уже в первых экспериментах, проведенных при комнатной температуре, мы обнаружили положительную и высоко достоверную корреляцию между приростом высвобождения АТР и гемоглобина, вызванным 20-мин инкубацией эритроцитов человека в условиях гипоксии. При переходе к физиологическим условиям (to=37oC), мы обнаружили, что в эритроцитах человека гипоксия вызывала увеличение гемолиза на 40%, в то время как в эритроцитах крысы этот параметр увеличивался в 2-3 раза. Для нашего дальнейшего исследования важен был то факт, что в отличие от эритроцитов крысы в эритроцитах человека отмечена существенная индивидуальная вариабельность действия гипоксии. Учитывая это обстоятельство, дальнейшие эксперименты были проведены на эритроцитах крыс линии Вистар. Мы обратили внимание на то, что 2-3-х кратное увеличение высвобождения гемоглобина в ответ на 20-мин гипоксию эритроцитов крысы сопровождалось лишь незначительным и статистически недостоверным приростом содержания внеклеточного АТР, что обусловлено 35-ти кратным увеличением при переходе от комнатной температуры к 37оС активности экто-ATPазы. В самом деле, добавление ингибитора этого фермента (соединение ARL 67156) приводило к резкому приросту содержания внеклеточного ATP, не влияя при этом на высвобождение гемоглобина. В присутствии ARL 67156 нам также удалось зарегистрировать положительную корреляцию прироста высвобождения АТР и гемоглобина из эритроцитов крысы, подвергнутых 20-мин гипоксии при 37оС. Нам не удалось обнаружить достоверного влияния карбенокcолона на выброс ATP из эритроцитов крысы в условиях гипоксии, в то время как незначительное снижение этого параметра в присутствии пробенецида коррелировало с уменьшением гемолиза эритроцитов. В отличие от гипоксии, выброс АТР из эритроцитов крысы, вызванный механическим воздействием (shear stress) блокировался карбенокслолном. Следует, однако отметить, что в этой работе не проводилось одновременная оценка влияния механического воздействия на гемолиз эритроцитов. Последнее обстоятельство оказывается весьма существенным в свете данных о корреляции выброса АТР и гемоглобина из эритроцитов человека в ответ на механическое воздействие, гипотонический шок и добавку диметилсульфоксида, используемого в качестве растворителя гидрофобных соединений. На основании этих результатов мы сделали вывод о том, что нарушение структурной целостности плазматической мембраны вносит существенный вклад в высвобождение АТР из эритроцитов в условиях гипоксии и приступили к изучению механизма этого явления. Используя метод безметочного определения содержания белков, мы сравнили относительное содержание 1159 белков теней эритроцитов, полученных при номоксии и гипоксии в 3 независимых экспериментах. Среди белков, чье содержание в условиях гипоксии увеличивалось более чем в 2 раза, мы обнаружили 6 субъединиц гемоглобина. Эти данные, полученные при деоксигенации интактных эритроцитов, согласуется с результатами предыдущих исследований связывания окисгенированного и дексигенированного гемоглобина с тенями эритроцитов человека. Этот феномен очевидно обусловлен взаимодействием деоксигемоглобина с белком полосы 3, продемонстрированным в опытах по связыванию деоксигемоглобина с цитопламатическим доменом белка полосы 3. В последнее время роль взаимодействия deoxy-Hb с белком полосы 3 в регуляции цитоскелета эритроцитов была подтверждена также в исследовании эритроцитов мышей, содержащих нативный белок полосы 3 человека (w-human Hb site) или белок полосы 3, лишённый сайта связывания deoxy-Hb (w/o Hb site). Эти эксперименты показали, что в отличие от мышей дикого типа и мышей w-human Hb site, дезоксигенирование не оказывает никакого влияния на взаимодействие белка полосы 3 с цитоскелетом и высвобождение ATP из эритроцитов мышей w/o Hb site . В ранних работах было показано, что тени эритроцитов человека обогащены белками мультиферментного комплекса, играющими ключевую роль в регуляции гликолиза. Сравнительно недавно с использованием пермеабилизованных эритроцитов и фермент-специфических антител, было обнаружено, что в условиях гипоксии глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, альдолаза, фосфофруктокиназа, лактат дегидрогеназа и пируваткиназа диссоциируют с внутренней поверхности мембраны. Предполагается, что это явление лежит в основе увеличения метаболизма глюкозы в гликолизе в условиях гипоксии, контролируя тем самым продукцию NADPH и инактивацию АФК. Нам не удалось обнаружить достоверного влияния гипоксии на содержание этих ферментов в тенях эритроцитов крысы. В этой связи можно предположить, что в отличие от белков, перечисленных в Таблице 4, взаимодействие гликолитических ферментов с мембраной обусловлено крайне слабыми взаимодействиями, и различия в их содержании, зарегистрированные в интактных эритроцитах, исчезают в процессе многократной промывки мембран. Исследования последних лет показали, что белки группы Cullin образуют молекулярный каркас, который выполняет решающую роль в посттрансляционной модификации белков посредством их убиквитинилирования. У млекопитающих семейство куллины образовано 8 беклами (CUL1-CUL7 и PARC), которые характеризуются наличием одноименного домена. В свою очередь, белки CUL1-CUL7 образуют субъединичные комплексы с группой Е3 лигазы, состоящей более чем из 200 белков (Cullin-RING E3 ubiquitin ligase complexes, CRL). Эти комплексы переносят убиквитин на белки как метку для их последующей деградации на протеосомах. Анализ данных, полученных с помощью базы данных KEGG, показывает, что большинство белков этого комплекса присутствуют в контрольных образцах и отсутствуют в тенях, полученных из эритроцитов, подвергнутых 20-мин гипоксии. Эти данные позволяют предположить, что в условиях нормоксии этот комплекс ассоциирован с мембраной эритроцитов, осуществляя убиквитинилирование мембранных белков, нарушенных в результате продукции АФК. Другим участником этого процесса могут быть кислород-чувствительные протеазы, вовлеченные в деградацию белков мембранного цитоскелета, включая белок полосы 3, белок 4.1 и гликофорин-С. В условиях гипоксии деоксигемоглобин связывается с цитоплазматическим доменом белка полосы 3, что приводит к высвобождению из мембраны комплекса Cullin-Rbx E3 и нарушению деградации мембранных белков, подвергнутых посттрансляционной модификации. Результатом всех этих изменений структурной организации мембранносвязанных белков является нарушение структурной целостности эритроцитов, приводящие к синхронному высвобождению АТР и гемоглобина, зарегистрированном в наших экспериментах.