Диссертация

В работе продемонстрировано, что наряду с общепринятым нелинейно-оптическим механизмом лазерного поглощения и образования парогазовых пузырьков в биоматериале за счет образования плазмы возможно также протекание альтернативного механизма. Так, при воздействии на биоматериал клетки цугом фемтосекундных лазерных импульсов при плотности мощности достаточной для формирования плазмы низкой плотности образуются центры окраски с полосой поглощения в ближнем ИК диапазоне на длине волны лазерного излучения. Центры окраски выступают в качестве точечных абсорберов энергии лазерного импульса и сопутствуют образованию парогазового пузырька за счет линейного поглощения энергии лазерного импульса. Показано, что центры окраски, образующиеся из органического материала клетки, можно классифицировать как углеродные точки (C-Dots). C-Dots, формируемые в зоне плазмы низкой плотности, можно использовать в качестве трекинг-частиц. Их люминесценция с максимумом около 530 нм возбуждается как однофотонно (светом с длиной волны менее 450 нм), так и двухфотонно (импульсами фемтосекундного лазера с длиной волны от 720 до 900 нм). Предложен метод прицельного формирования C-Dots внутри клетки без повреждения цитоплазматической мембраны и их использования в качестве люминесцентной метки для изучения внутриклеточных процессов. Показан пороговый характер образования парогазовых пузырей при фемтосекундном лазерном воздействии на различные области живых клеток (цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, ядро, ядрышко) и определены параметры порога воздействия. Установлено, что при воздействии лазерным импульсом с превышением порогового значения не более чем вдвое, воздействие фемтосекундного лазера на доимплантационные эмбрионы и ооциты млекопитающих можно рассматривать как не инвазивное. Изучена зависимость между вероятностью образования парогазового пузырька и слиянием клеток эмбриона мыши на стадии двух бластомеров. Показано, что образование парогазового пузыря является необходимым, но недостаточным условием для слияния клеток. Помимо слияния, в результате лазерного воздействия реализуются исходы: две клетки не сливаются, одна из клеток разрушается, а вторая сохраняется, и обе клетки разрушаются. В дальнейшем две слившиеся клетки, две не слившиеся клетки и эмбрион с одним разрушенным бластомером способны развиваться до стадии бластоцисты. Образование полости бластоцисты во всех случаях происходит одновременно, что доказывает, что «клеточные часы» эмбриона не нарушаются даже после слияния или разрушения одного бластомера. С использованием клеток, экспрессирующих GFP, показано, что образование парогазового пузырька в области контакта двух клеток приводит к обмену и гомогенизации гиалоплазмы как в случае образования одной слитой клетки, так и в случае, когда слияние не произошло. С помощью методики создания люминесцентных меток C-Dots показано, что при образовании единой клетки (обе мембраны двух клеток слились в единую мембрану) цитоплазма, происходящая из разных клеток, полностью не перемешивается. Установлен механизм тетраплоидизации при лазерном слиянии. Показано, что тетраплоидность возникает по механизму «проскальзывания» митоза.