Диссертация

Цели и задачи Целью данного исследования было изучение влияния мутаций на структуру, межбелковые взаимодействия и кластеризацию катионных каналов in vitro. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучение кластеризации мутантного грамицидина в модельных липосомах с помощью криоэлектронной микроскопии; 2. Расчет трёхмерной реконструкции канала Kv10.2 c удаленным N- концевым доменом с помощью электронной микроскопии макромолекул; 3. Изучение влияния N-концевого домена на функциональное состояние канала Kv10.2 и транспорт его к мембране; 5 4. Изучение взаимодействия каналов Kv10.2 с цитоскелетом и его кластеризации в клеточной мембране. Научная новизна и практическая значимость работы В данной диссертационной работе с помощью метода просвечивающей электронной крио-микроскопии была впервые показана олигомеризация мутантного грамицидина в липосомах с образованием пентамера с порой в центре, способной пропускать высокомолекулярные соединения и получена трехмерная реконструкция олигомера мутантного грамицидина,. Впервые в гетерологичной системе экспрессированы калиевые каналы человека Kv10.2 с удаленными N-концевыми доменами в положениях: Δ2-24, Δ2-134 Δ24-134. Изучено распределение мутантных каналов в клетках COS1 и их солокализация с актиновым цитоскелетом. Исследованы их электрофизиологические свойства. Получена впервые структура канала Kv10.2Δ24-134 с использованием метода электронной микроскопии макромолекул. Предложена модель активации каналов Kv10.2. Полученные результаты могут быть использованы при разработке новых методов направленного мутагенеза с целью регуляции активации ионных каналов, а также в учебном процессе при модификации существующих и разработке новых образовательных курсов для студентов высших учебных заведений. Положения, выносимые на защиту 1. При замене аланина в третьем положении на лизин [Lys3]gA образует в модельных мембранах кластеры диаметром 40Å, имеющие пятилучевую симметрию и состоящие из 10 пептидов. Кластеры имеют посередине пору c диаметром ~16Å, достаточную для выхода из липосом высокомолекулярных красителей; 2. Мутации в N-концевом домене (Δ2-24, Δ2-134 Δ24-134) канала Kv10.2 приводят к формированию неактивной формы тетрамерного канала. Отсутствие N-концевого домена приводит к нарушению мембранной экспрессии и к аномальной кластеризации канала в клетках. N- концевой домен канала отвечает за взаимодействие с актином; 3. Канал Kv10.2 активируется в соответствии с лиганд-рецепторным механизмом. Публикации По материалам работы опубликовано 4 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ, и 10 тезисов в сборниках научных конференций.