Диссертация

Тиамин (Витамин В1), помимо известной роли в качестве кофермента тиаминдифосфата, обладает также некоферментным действием на различные белковые мишени у млекопитающих. Целью работы было идентифицировать новые мишени действия тиамина, его производных и антагонистов и охарактеризовать механизмы действия тиамина для направленной регуляции метаболизма млекопитающих. С помощью аффинной хроматографии на тиамин-содержащей сефарозе, масс-спектрометрии и биоинформатического анализа было показано, что фосфатазы семейства DING могут участвовать в метаболизме тиаминфосфатов млекопитающих. С использованием ингибиторного анализа установлено, что антагонисты тиамина ампролиум и пиритиамин, применяемые для создания моделей тиаминового дефицита, ингибируют пиридоксалькиназу, а среди фосфатов тиамина наиболее сильный ингибитор – тиаминтрифосфат. С использованием кинетических исследований и полученных структур комплексов глутаматдегидрогеназы быка с ADP (разрешение 2,25 Å) и лейцином (разрешение 2,44 Å) охарактеризованы молекулярные механизмы регуляции глутаматдегидрогеназы путем ацетилирования остатков лизина в центрах связывания лейцина (К200), GTP (К503) и ADP (К84 и К545). Показана суточная регуляция тиамин-зависимых ферментов пост-трансляционными модификациями in vivo: ацетилированием (К503 глутаматдегидрогеназы) и фосфорилированием (S213 и S285 пиридоксалькиназы и S293 пируватдегидрогеназы) – и изменение такой регуляции при введении высоких доз тиамина. Регуляция этих мишеней тиамином вносит вклад в защитное действие тиамина в моделях нейропатологий. В раковых клетках некоферментное действие тиамина/ТДФ имеет большое значение для антираковой терапии. Взаимодействие ТДФ с сигнальным путем р53-р21 в клетках аденокарциномы А549 приводит к переключению потоков субстратов в метаболическом узле взаимопревращений 2-оксоглутарата и глутамата, критическом для жизнеспособности данных клеток. Таким образом, были найдены новые мишени и охарактеризованы механизмы некоферментного действия тиамина, его производных и антагонистов, включающие как прямую регуляцию активности ферментов, так и влияние на посттрансляционные модификации белков у млекопитающих.